Naast 150 gloednieuwe breinbrekers en een nieuwe serie minigames in de koffer van de professor, biedt Professor Layton en het Masker der Wonderen je toegang tot 365 extra dagelijkse puzzels die worden verdeeld via het Nintendo Network. Dat is dus elke dag een nieuwe puzzel, tot een jaar na de lancering van het spel.

Dit vijfde deel in de serie begint met Layton, Luke en Emmy, korte tijd na de gebeurtenissen in 'Professor Layton en de Melodie van het Spook'. Het dappere drietal krijgt het verzoek om een halt toe te roepen aan de mysterieuze Gemaskerde Heer, die de stad Monte d'Or terroriseert met duistere toverkunsten, waardoor de bewoners bijvoorbeeld in steen veranderen. De professor vermoedt de invloed van het Masker der Chaos, een masker dat volgens de verhalen bijzondere krachten geeft aan wie het draagt. Zijn onderzoek voert Layton terug naar een duistere periode in zijn verleden, waar misschien wel de oplossing schuilt voor de problemen van het heden. Tijdens flashbacks maken spelers kennis met Laytons ouders en zijn jeugdvriend Randall, en kunnen ze spelen met de 17-jarige Layton, wiens passie voor de archeologie hem duur komt te staan…

De handgetekende stijl die bekend is van eerdere spellen in de serie krijgt in Professor Layton en het Masker der Wonderen nieuwe diepgang door 3D-personages en -animaties. Het spel bevat ook een heel nieuwe spelstand waarin de jonge Professor Layton oude ruïnes verkent. Hierin moet de speler hem voorbij hindernissen en mummievijanden loodsen om de uitgangen van de mysterieuze kamers te bereiken.

In de koffer van de professor verschijnen drie nieuwe minigames. In de speelgoedrobot-uitdagingen moet je een opwindbaar speelgoedrobotje besturen dat telkens drie stappen tegelijk zet. Kun jij het robotje voorbij de apparaten tot aan de finish loodsen? De tweede minigame is winkeltje-van-alles, waarin wordt getest hoe aantrekkelijk je winkelplanken met voorraad kunt vullen. Je slaagt alleen wanneer je klanten in één aankoop alles van de planken kopen. In de derde minigame, konijnenshow, help je Luke een circuskonijn te trainen voor nieuwe trucs en uitvoeringen, om de circusbaas te overtuigen het konijn weer te laten optreden.